分子分型是非小细胞肺癌（NSCLC）实施靶向治疗的前提，选择准确、快速、恰当的检测方法，全面筛选出适用靶向药物的目标人群具有重要意义。《肿瘤瞭望》邀请敦化市医院崔茹龙教授、蚌埠医学院第一附属医院陈余清教授、永城市人民医院陈凯教授、潜江市中心医院李文斌教授和太仓市中医医院吕红教授解读分子病理检测权威指南，分享分子病理检测临床实践经验。
分子分型是非小细胞肺癌（NSCLC）实施靶向治疗的前提，选择准确、快速、恰当的检测方法，全面筛选出适用靶向药物的目标人群具有重要意义。《肿瘤瞭望》邀请敦化市医院崔茹龙教授、蚌埠医学院第一附属医院陈余清教授、永城市人民医院陈凯教授、潜江市中心医院李文斌教授和太仓市中医医院吕红教授解读分子病理检测权威指南，分享分子病理检测临床实践经验。
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崔茹龙教授
近几年来，精准检测技术推陈出新，各种检测标准相继出台，为NSCLC患者的精准检测及靶向治疗提供了临床指南。下面我们请陈余清教授和陈凯教授对《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》[1]的ALK检测部分进行解读。
陈余清教授：肺癌已成为肿瘤精准诊断和精准治疗的典范。只有实现精准分子病理检测，才能够对疾病进行精准分型，找出最适合患者的靶向药物。精准治疗，检测先行，这已经成为临床医生需要持之以恒贯彻的终极理念。2009年公布的IPASS研究[2]揭开了肺癌分子靶向治疗的序幕，研究结果提示EGFR敏感突变患者采用EGFR-TKI吉非替尼治疗相比化疗可获得更多无进展生存（PFS）和总生存（OS）获益，但EGFR突变阴性患者采用吉非替尼治疗没有显著获益，客观缓解率（ORR）只有1.1%，可见驱动基因检测非常重要。多年来我国一直在贯彻推广以精准检测指导临床精准治疗的理念，已经得到了很好的社会反馈，使更多患者取得了更长的生存期和更好的生活质量。
中国和亚洲NSCLC患者的驱动基因突变谱与欧美人群有所不同，主要体现在腺癌，包括EGFR（45%~55%）、KRAS（8%~10%）、ALK（5%~10%）、ROS1（2%~3%）、MET（2%~4%）、HER2（2%~4%）、BRAF（1%~2%）、RET（1%~4%）、NTRK（<1%）、NRG1/2（<1%）、FGFR2（<1%）等，除极少数病例存在共突变外，上述基因变异在同一个病例中普遍存在互斥现象。
分子病理检测的适用人群包括：⑴拟进行靶向治疗的肺浸润性腺癌（或包括含腺癌成分的NSCLC）患者需进行靶分子基因检测，因为这类患者驱动基因阳性的比例相当高。⑵经活检组织病理学证实为非腺癌的晚期NSCLC患者可推荐进行靶分子基因检测，除肺腺癌外，靶分子基因变异也存在于肺腺鳞癌、非特指型NSCLC、大细胞肺癌及肺肉瘤样癌等患者，检测出的驱动基因阳性患者可在靶向治疗中获益。⑶对于EGFR、ALK等驱动基因变异阴性晚期NSCLC患者，推荐进行PD-L1表达检测，判断患者是否适合PD-1/PD-L1抗体药物免疫治疗，PD-L1≥50%的高表达人群适合免疫单药或双免治疗，免疫联合化疗方案可使一部分PD-L1低表达或阴性患者获益。
基因检测应贯彻在疾病全程管理过程中，例如早期NSCLC患者手术后若检测出驱动基因阳性，可以进行术后辅助靶向治疗，ADAURA研究[3]已经证明根据检测结果进行术后辅助靶向治疗可使很大比例的患者获得60个月以上的生存期。对于术后复发的患者，再次进行基因检测依然可以筛选出能从靶向治疗中获益的人群。对于晚期患者，基因检测的意义更大。不同驱动基因之间存在互斥的现象，也有极少数患者存在共突变，共突变患者的靶向治疗效果一般较差，因此基因检测对于判断患者预后也是有帮助的。
陈凯教授：NSCLC常用分子病理检测方法包括5种：Sanger测序、荧光原位杂交（FISH）、即时定量PCR (qRT-PCR)、二代测序（NGS）和免疫组化(IHC)。下面我将分别介绍这几种方法的优缺点和适用范围。
Sanger测序：Sanger是检测EGFR基因突变的金标准，不足之处是敏感性低，检测程序比较繁琐，阳性率较低，现在临床上基本不再使用。
FISH：ALK、ROS1基因重排和MET基因扩增检测的金标准，缺点是只能检测单基因变异，检测范围相对窄。
IHC：主要用于PD-L1基因检测、ALK易位检测以及其他少见靶点检测，IHC检测范围也相对较窄。
NGS：NGS可同时检测多个靶分子及其多种变异类型，包括罕见靶点，目前比较受推崇。NGS检测范围比较广，包括大Panel和小Panel。缺点是目前常用的DNA模板的NGS检测容易漏诊，如果临床采用RNA+DNA NGS检测，可以检测的更全面。
PCR：荧光定量PCR检测具有快速、简单及性价比高的优点，可以检测EGFR、ALK和ROS1基因的已知变异类型，缺点是只能检测已知突变或重排/融合位点，检测基因的数量相对较少。
所有分子病理检测方法均具有优缺点，检测的准确性受所检基因变异类型和数量、标本类型、标本数量和质量、实验室条件等影响，具体而言：⑴常见基因突变的检测相对容易，为了提高罕见突变检测的准确性，可能需要两种检测方法进行联合检测。⑵基因突变数量越多，越容易被检测出。⑶常见送检标本类型包括肿瘤组织、细胞学标本（例如胸水）和血液标本等。推荐大标本检测（大标本是指手术切除后获取的标本，小标本则是指通过支气管镜、胸腔镜活检或穿刺活检等方式获取的活检标本），标本取材越多，基因检测阳性率会更高一些。例如，目前临床常用的18号穿刺针取材，圆形针相比扁形针获得的标本的检测阳性率更高，基因检测一般需要穿刺三针以上。⑷实验室条件，实验室设备先进且检测流程符合规范有助于提高检测准确性。
关于检测哪些基因，选择大Panel还是小Panel，应依据患者个人的经济条件和治疗意愿。若经济条件较好的患者希望获得更广泛的治疗选择，包括国内未上市的药物，可选择大Panel检测，检测范围也包括肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定/错配修复（MSI/MMR）等，PD-L1表达另外检测。经济条件一般的患者可进行小Panel检测，指南推荐需要检测的致癌驱动基因包括EGFR、ALK、ROS1、KRAS、MET（第14号外显子跳跃突变和MET扩增）、HER2、BRAF、RET和NTRK等。二次活检后的基因检测范围更广一些，因为这种情况下更可能出现旁路激活和少见突变。
对肺腺癌、经小样本活检诊断鳞癌或混合腺癌成分的患者应进行基因检测。肺浸润性腺癌患者均需进行靶分子基因检测。很多医生不重视鳞癌患者的基因检测，然而部分由活检证实为鳞状细胞癌的患者，经术后病理证实存在肺腺癌成分，而且近些年来，肺鳞癌中的驱动基因检出率也在逐步提高，包括常见基因EGFR和ALK，有研究显示鳞癌患者中ALK基因融合发生率可达3.7%[4-5]因此基因检测对鳞癌患者也很重要。靶向治疗相比化疗可为驱动基因阳性NSCLC患者带来PFS和OS显著改善，尤其是ALK突变，临床医生应重视对鳞癌等NSCLC患者进行基因检测，尽量不要让携带驱动基因突变的患者失去靶向治疗的机会。
崔茹龙教授
ALK是肺癌发生发展的重要驱动基因之一。据当前的指南共识，目前常用的ALK检测方法有多种。有请李文斌教授谈谈作为一名临床医生，如何为患者选择合适的ALK检测方法？
李文斌教授：精准、快速、规范的ALK检测对于甄选可从ALK抑制剂治疗中潜在获益的人群非常重要。目前，我国批准的ALK基因检测方式包括四种：Ventana-D5F3 IHC、FISH、PCR和NGS。
FISH是ALK融合突变检测“金标准”，检测方法较简单，对标本的要求较少，缺点是费用较高，经济效益比不佳。IHC是一种有效、快捷的检测方法，主要缺陷是只能用于肺腺癌的基因检测，对于非腺癌的病理类型，采用IHC评估ALK融合突变时应慎重，2023NCCN指南[6]则指出，FISH分离探针法是首个广泛用于ALK重排检测的方法，而IHC可作为一种可单独使用的有效筛查策略，其检测结果不需要FISH检测再确认。PCR的灵敏度和精准度都比较高，但是只能用于检测已知ALK融合突变类型，所以可能存在假阴性结果。NGS的精准度和灵敏度都较好，除了已知突变，NGS还可以发现一些未知突变，主要缺点是NGS的准确度会受到捕获探针的覆盖区域、覆盖度以及标本DNA质量等因素的影响。在实际临床工作中，我们应该根据患者的实际需求、治疗目的来选择基因检测方式，如果只需了解患者的治疗基因（比如ALK单基因检测），可以选择免疫组化或FISH，如果希望同时检测其他的驱动基因、罕见基因或伴侣基因，则需要依赖于PCR或NGS检测。
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